糖蛋白染色試劑盒

● 產品簡介：                                                

本產品用于PAGE 凝膠或蛋白免疫印記硝酸纖維素膜上糖蛋白的檢測。整個染色2.5小時完成。染色后的糖蛋白為品紅色條帶，背景為淺粉色或者無色。該試劑盒檢測的靈敏度一般可以達到微克級別，但實際靈敏度跟靶蛋白糖基化程度相關，可以用于 SDS-PAGE 和2D電泳的凝膠檢測，也可以用于瓊脂糖凝膠電泳的檢測（但背景較高），還可以用于硝酸纖維素印跡膜的檢測。

按照每次使用25 ml糖蛋白染色試劑計算，本產品可以染色 8-10塊mini-PAGE（8×10cm）膠或印跡膜。

● 產品組成：

● 儲存條件

按照標簽溫度貯存，常溫運輸。開封后一年有效。

●實驗前準備：

1. 配制 3%醋酸溶液：將 15 ml 自備的冰醋酸與 485 ml 超純水混勻，常溫保存備用。

2. 配制 50%甲醇溶液：將 250 ml 甲醇與 250 ml 超純水混勻，常溫保存備用。

3. 配制氧化試劑溶液： 將本試劑盒提供的氧化試劑干粉轉移到本試劑盒提供的250ml空塑料瓶中， 然后加入250 ml的超純水，充分混勻溶解后得到氧化試劑溶液，常溫保存備用。

4. 配制還原試劑溶液： 將本試劑盒提供的還原試劑干粉轉移到本試劑盒提供的 250ml 空塑料瓶中，然后加入 250 ml的超純水，充分混勻溶解后得到還原試劑溶液，常溫保存備用。

5. 配制1×SDS-PAGE上樣緩沖液：取0.4 ml 5×MonoClolor 蛋白上樣緩沖液，加入1.6 ml超純水，-20℃貯存備用。

6. 配制陽性對照（辣根過氧化物酶）溶液：向裝有 1 mg 辣根過氧化物酶固體的棕色管中加入 1 ml 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液，所得辣根過氧化物酶溶液的濃度即為 1mg/ml，然后適量分裝成8-10管， 留下一管當天使用， 其余的放-20℃長期保存。 對于 8×10 cm的凝膠來說，每條泳道加 10 μl 的陽性對照溶液即可，上樣前95℃處理5分鐘。

7. 配制陰性對照（大豆胰蛋白酶抑制劑）溶液：向裝有 1 mg 大豆胰蛋白酶抑制劑干粉的管中加入 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液（自備），所得大豆胰蛋白酶抑制劑溶液的濃度即為 1 mg/ml，然后適量分裝成8-10管， 留下一管當天使用，其余的放-20℃長期保存。對于 8×10 cm的凝膠來說，每條泳道加 10 μl 的陽性對照溶液即可，上樣前95℃處理5分鐘。

8. 樣品稀釋：用 5×MonoClolor 蛋白上樣緩沖液將樣品濃度稀釋為 1 mg/ml，SDS-PAGE 上樣緩沖液終濃度為 1×。對于 8×10 cm的凝膠來說，每條泳道加 5-10 μl 的樣品即可，上樣前95℃處理5分鐘。。

● 凝膠染色的操作步驟（膜染色從步驟3開始）：

注意事項：

1.以下步驟僅針對0.75mm厚度大小8×10cm的凝膠，1-1.5mm厚度凝膠或更大體積凝膠適當增加液體體積并延長操作時間。

2. 請在通風櫥中進行以下操作。

一. 固定：

取出電泳后的 SDS-PAGE 凝膠，在50 ml 50%甲醇溶液中，搖床慢搖30分鐘，棄甲醇溶液。

二. 漂洗：

50 ml超純水洗滌凝膠兩次，每次搖床慢搖10分鐘，棄超純水。

三. 氧化：

凝膠中加入 25 ml 氧化試劑，搖床慢搖15分鐘，棄溶液。

四. 漂洗：

50 ml超純水洗滌凝膠3次，每次搖床慢搖5分鐘，棄溶液。

五. 染色：

凝膠中加入25 ml糖蛋白染色試劑，搖床慢搖15 分鐘，糖蛋白會在5-10分鐘內顯現品紅色。若檢測的糖蛋白含量較低，適當延長顯色時間。棄染色溶液。

注：若糖蛋白染色試劑中有晶體析出，只需取上清液即可，不要加熱溶解晶體。

染色步驟會產生有刺激性氣味氣體，請在通風櫥中操作。

六. 還原：

凝膠中加入 25 ml 還原試劑，搖床慢搖15分鐘，棄溶液。此時凝膠背景略帶紅色。

七. 漂洗：

加入50 ml 3%醋酸溶液搖床慢搖洗滌膠塊3次，每次10分鐘，直至膠背景紅色變淺，接近淡紅色或無色，此時紅色糖蛋白主帶清晰可見。

八. 保存：

膠塊保存在50 ml 3%醋酸溶液中。

● 實驗記錄表格

實驗日期：

實驗示例：

蛋白轉到NC膜后糖蛋白染色

使用該產品發表部分文章列表：

1. [IF=8.947 Adhesive property and mechanism of silkworm egg glue protein.

Author: Yutian Lei, Kaiyu Guo, Yan Zhang, Xiaolu Zhang, Lixia Qin, Xin Wang, Hongtao Zhu, Yuanyuan Guo, Wenxin Yang, Benchi Li Qingyou Xia, Ping Zhao, Zhaoming Dong

Journal: Acta Biomaterialia. Volume 134, 15 October 2021, Pages 499-512

Institution： Southwest University

Paper link：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1742706121004773