植物Rubisco測定試劑盒
● 產品組成：Plant Rubisco
Assay Kit
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組分貨號
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名稱
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規格
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貯存
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運輸
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PU1060-01
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試劑1-Rubisco提取緩沖液（2×）
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100 ml
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4℃
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常溫
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PU1060-02
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試劑2-10×Assay buffer
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15 ml
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-20℃
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常溫
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PU1060-03
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試劑3-GAPDH（200×）
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1 KU/1ml
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-20℃
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常溫
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PU1060-04
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試劑4-PGK（100×）
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500 U/1ml
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4℃
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常溫
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PU1060-05
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試劑5-CPK（100×）
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1 KU/1ml
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-20℃
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常溫
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PU1060-06
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試劑6-ATP（100×）
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1.2 ml
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-20℃
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常溫
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PU1060-07
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試劑7-CrP（100×）
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1.2 ml
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-20℃
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常溫
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PU1060-08
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試劑8-NADH（100×）
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1.2 ml
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-20℃
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常溫
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PU1060-09
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試劑9-RuBP
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1.4 ml×2
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-20℃
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常溫
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PU1060-10
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試劑10-酶溶解緩沖液
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5 ml
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-20℃
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常溫
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DE005
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試劑11-滅菌水
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100 ml
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4℃
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常溫
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BSA-02
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試劑12-BSA溶液 50mg/ml
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5 ml
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-20℃
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常溫
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DT0140P
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試劑13-1MDTT（100×）
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1 ml×2
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-20℃
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常溫
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PC2030-01
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蛋白酶抑制劑 植物樣品提取用(100×)
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1 ml
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-20
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常溫
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● 產品簡介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調節酶，是植物中最豐富的蛋白質，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50％～60％。
這里1分子CO2被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可計算Rubisco的活性，由340nm吸光度的變化可計算NADH氧化的量。
為了使NADH的氧化與CO2的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統。
按照1 ml 反應體系計算，該試劑盒可以測定80-100個樣品。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設備；1.5ml離心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度計；制冰機；低溫離心機
● 操作步驟：
一、 即用型Rubisco提取緩沖液配制：
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一個反應配制體積
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n個反應配制體積
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1 ml
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n×1 ml
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Rubisco提取緩沖液（2×）
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0.5 ml
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n×0.5 ml
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滅菌水
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470 μl
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n×470 μl
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1 M DTT（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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BSA溶液50mg/ml
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20 μl
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n×20μl
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蛋白酶抑制劑（100×）
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10 μl
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n×10μl
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注：1. 即用型Rubisco提取緩沖液盡量現配現用，短期4℃中可以過夜保存。
2. 為增強Rubisco的穩定性，提取緩沖液中可以加入蛋白酶抑制劑（Cat：PC2030）
二、 Rubisco樣品提�。�
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大�。┗�0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 10分鐘，上清即為Rubisco樣品提取液，常溫放置備用（不要冰浴或4℃放置，常溫放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco樣品提取液最好立即測定，不建議保存。
三、 Rubisco活性測定分析：
1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
按照標簽所示，在試劑10-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-GAPDH和試劑5-CPK按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
3. 試劑4-PGK為硫酸銨懸浮液，4℃12000g離心5分鐘，去除上清（小心去除，可以保留少許上清，不要吸棄沉淀），沉淀中按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
4. 試劑9-RuBP：按照標簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：RuBP溶液穩定性較差，用后-20℃保存，有效期3-4天，長期-80℃保存。
5. 試劑8-NADH：按照標簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長期-80℃保存。
6. 反應體系MasterMix配制：
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加入順序
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組份
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1ml反應體系加入量
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MasterMix配制
（測定n個樣品為例）
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1
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10×Assay
Buffer
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100 μl
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n×100μl
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2
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滅菌水
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795μl
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n×795μl
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3
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ATP溶液（100×）
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10 μl
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n×10μl
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4
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CrP溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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5
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GAPDH溶液（200×）
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5 μl
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n×5 μl
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6
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PGK溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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7
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CPK溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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8
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NADH溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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7. 反應體系測定；
1.5 ml離心管中配制以下反應。
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1
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2
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3
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對照反應
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初始活性測定
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總活性測定
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MasterMix
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950 μl
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950 μl
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950 μl
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即用型Rubisco提取緩沖液
（步驟一）
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25 μl
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-
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-
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Rubisco樣品提取液
（步驟二）
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-
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25μl
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25μl
常溫放置15分鐘
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試劑9-RuBP溶液
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25
μl
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25 μl
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25μl
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加入RuBP后立即測定OD340讀數，記錄60秒內OD340值變化。
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注：一般分光光度計OD340讀數在0.5-3之間數據比較準確，低于此范圍說明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范圍說明所用材料太多，Rubisco活性太高，此時可以將Rubisco樣品提取液用即用型Rubisco提取緩沖液稀釋后測定。
四、Rubisco活性計算：
根據如下公式計算樣品中Rubisco活初始性和總活性：
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應最初1分鐘內340nm處測定管吸光度變化的絕對值
N-稀釋倍數，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測定時間，本程序為60秒
S-cm2 提取時使用的葉面積
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